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微小核醣核酸偵測技術將再進一步推動生醫產業發展
發佈日期:2018/01/05
資料來源:台灣大學 生化科技系
內容:

台灣大學 生化科技系 張英風博士

壹、發展背景

        近年來,世界各國主要投入的研發領域除了物聯網外,非生物科技領域莫屬了。其中新藥領域更是許多專家積極投入研究的課題,因此除了傳統大藥廠之外,許多中小型研發公司的興起,更是說明了生技領域的蓬勃發展情況。然而,新藥開發從基礎探索研究到上市通常約需耗費10-15年期間,投入的平均成本更是高達26億美元(2015年統計),為了能夠更有效的開發出新藥,「精準」成為這些研究團隊的重要考量因素。

        根據2017年的統計,全球正在研發中的新藥約有1.4萬件,其中以抗癌用藥佔最大比例(5千件),若是以產品類別來看,生技藥品及改良新藥是主要的開發方向。而為了能夠針對癌症、腫瘤開發出有效治療用藥,在臨床試驗階段就必須仰賴精準的生物標誌技術來進行實驗設計及患者篩選,如此才能節省實驗的時間與數量,也才能夠降低成本的耗費,特別是許多研究團隊正在積極開發的癌症用藥,就更加迫切的需要新的生物標記技術。

貳、微小核醣核酸偵測技術介紹

一、微小核醣核酸簡介

      微小核醣核酸(microRNA, miRNA)為內生型的小片段單股RNA,長度約為18 - 24個核苷酸,屬於DNA轉錄後不會轉譯成蛋白質的非編碼RNA(non-coding RNA),至今已有超過4,000個人類的miRNA被鑑定出來。

       miRNA序列具有高度保留性,相同編碼的miRNA可以在不同物種間發現。miRNA的生成首先經RNA聚合酶在核內轉錄產生長度約幾百個核苷酸的primary miRNA,透過核糖核酸梅Dorsha剪切形成70個核苷酸的precursor miRNA,並由細胞核送到細胞質。接著RNA內切酶Dicer剪切掉髮夾結構之迴旋處,形成18 - 24個核苷酸的miRNA/miRNA*雙股,藉由解旋酶打開雙股,其中一股能鑲嵌入蛋白質複合體(RNA-induced silencing complex, RISC)中,可以與目標信使核糖核酸(messenger RNA, mRNA)3’非轉譯區(3’ untranslated regions, 3’ UTR)互補,使mRNA被降解或抑制蛋白質轉譯作用,進而影響細胞發育、增生、分化及細胞凋亡。miRNA不僅存在於細胞內,文獻指出miRNA也會存在於血清、血漿、尿液、唾液等體液中,並且體液內miRNA的異常表現,經常與癌症、心血管疾病、神經退化性疾病有關。此外,目前的研究發現:miRNA可以藉由調控致癌或抑癌的基因表現來影響癌症的進程;甚至是當人體受到病源體感染時,我們還可藉由偵測體液中病源體的miRNA來做出診斷。由於miRNA可以在高溫、極端的酸鹼環境及反覆的凍乾循環中依然保持穩定,故其非常有潛力作為非侵入性疾病檢測的生物標記。

二、傳統的miRNA偵測技術

傳統的miRNA偵測方法有三種:

1. 北方墨點法 (northern blotting)

       北方墨點法首先利用電泳分開各種長度的RNA,再將其轉置到膜上與miRNA的偵測探針雜交反應,最後利用化學冷光或其他方式讀取訊號。一般來說,北方墨點法的缺點是:(a) 實驗工序繁瑣 (b) 實驗耗時過長 (c) 偵測靈敏度不夠高,但在許多文獻中,北方墨點法仍被當成miRNA偵測的黃金準則。

2. 定量反轉錄聚合酶鏈式反應 (quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction,  qRT-PCR)

       由於miRNA的長度僅18 - 24個核苷酸,原本並不合適利用PCR技術偵測,因為miRNA序列過短,使引子(probe)設計的難度大大增加;但近年來PCR技術突飛猛進,已有幾種方式可突破引子設計的障礙。就筆者所知,目前有兩種試劑在仿間販售,挾著其卓越的靈敏度(pM - fM)qRT-PCR儼然成為偵測miRNA新的黃金準則。不過利用qRT-PCR來偵測miRNA依然有其不利之處:(a) 試劑價格昂貴 (b) 需熟練的技術人來操作 (c) qRT-PCR的讀取儀器亦不便宜。

3. 微陣列分析 (microarray analysis)

       MiRNA的微陣列分析是在晶片上進行反應最後讀取螢光報導引子的訊號,此技術有絕佳的高通量能力,雖然在捕捉引子的設計及螢光分子的修飾上有其難處,不過最致命的缺點還是專一性欠佳,以致於無法大規模普及。

 

三、國際miRNA偵測技術趨勢

       目前尚在實驗室階段或才剛有產品問世,但常見於文獻報導的miRNA偵測技術可區分成以下幾大類:

1. 以電化學為基礎的miRNA偵測技術 (Electrochemical biosensors developed for miRNA detection)

       電化學miRNA偵測平台,是利用引子捕捉miRNA或其產物,並將此事件以電化學的訊號輸出,如電流(amperometric biosensors)、電壓(voltammetric biosensors)或阻抗(Impedimetric biosensors)。電化學偵測技術挾著:(a) 相對便宜的價格 (b) 其量測平台具微型化的潛力,早已被廣泛應用於食品、植物、環境、生醫分析等領域中。因此,在發展相對成熟的優勢下,利用電化學偵測技術來檢測miRNA的研究常擁有:(a) 極高靈敏度,有些研究甚至達到aM (b) 實驗操作簡單 (c) 分析時間短 (d) 有潛力實現重點照護檢驗(point-of care test, POCT1) …等優點。目前,國內外許多研究室或公司已將自己的技術商品化,只是就筆者所知,尚未有老牌大型生技公司如GEThermo FisherBioRadAgilent…等將其併入麾下產品線販售。

2. 以光學為基礎的miRNA偵測技術 (Optical biosensors developed for miRNA detection)

       與電化學miRNA偵測平台類似,以光學為基礎的miRNA偵測技術,需設計捕捉引子和標定光學活性報導分子標記的核酸探針,待與miRNA或其產物雜交後產生光學信號。主要可分為下列幾類:

(1) 光致發光型 (luminescence)

       發光型的光學miRNA偵測技術常將光學活性報導分子標記在核酸探針上,待與miRNA或其產物雜交後,即可產生發光信號(signal-on)或是使原本的光訊號猝滅(signal quenching)。常見的光學活性報導分子有:(I) 螢光分子(fluorescence dye) (II) 量子點(quantum dot)

(2) 表面電漿子型(surface plasmon)

       表面電漿子型的miRNA偵測技術有兩大類:

       (a) 金屬薄膜的表面電漿子共振(surface plasmon resonance)

       金屬薄膜的表面電漿子共振是一種存在於金屬與介電質界面的物理現象,入射光必須藉由耦合器來增加沿著界面傳播的波向量大小,如此才能激發出金屬層及介電物質層界面間之表面電漿子,使其沿縱向(longitudinal)共振運動。利用此技術偵測miRNA不須要標定其他分子,因此可以做到即時量測訊號;但一般生物檢體的樣本中,含有大量的蛋白質等其他非目標miRNA的干擾物,會造成量測誤差增加。所以目前利用金屬薄膜表面電漿子共振來偵測miRNA的研究,大多須結合其他核酸增幅技術或是訊號放大的手段才行。

       (b) 奈米金屬粒子的侷域表面電漿子(localized surface plasmon)

        侷域表面電漿子是奈米尺度(<100 nm)下的金屬粒子,其自由電子受到外加電磁場驅動而產生的集體震盪,我們可將之簡化成電偶極與外加電場作用,故會在某些波段有很強的消光現象(extinction)產生。此類侷域表面電漿子的miRNA偵測平台通常也會配合其他核酸增幅的手段,先增幅核酸再進行量測,主要是因為侷域表面電漿子產生的消光現象或侷域電場的增強,對於折射率變化的響應不是非常敏感所致。此外,合成奈米金屬粒子雖然不困難,但每批合成粒徑大小的均一化卻十分不易控制,因此利用此技術做定性分析容易,但要做到高靈敏度的定量分析就十分困難了。

 

參、結語

       以目前較多研究團隊或廠商使用的miRNA偵測技術有:(1) qRT-PCR (2) 微陣列分析 (3) 次世代定序法(next generation miRNA sequencing)。前兩項技術的概要已在前面簡述過,而第三個商用技術-次世代定序法,則是目前唯一可以偵測未知miRNA序列的技術,但其實驗、時間,與儀器成本比qRT-PCR還要高,要真的普及還有一段很長的路要走。

       考量近年政府投入大量資源鼓勵進行生醫領域的研發,加上精準醫療 (precision medicine)的發展趨勢,故液體活檢在這波浪潮中已成為全球各大藥廠或生技公司爭相發展的新興領域。由於液體活檢不須透過侵入性高的組織切片,只要採取如血液、唾液、尿液等體液來檢測其中的特定生物標記,就能做為癌症診斷、藥物治療選擇或預後評估的參考依據,若再配合基因檢測,預期可以作為促進精準醫療發展的重要基石,也建議未來可以鼓勵相關學研單位進行合作,加速完成新藥的開發。

1point-of care test, POCT尚無確切的中文名稱,泛指一種由非實驗室或臨床工作人員,且不在傳統的實驗室內進行的診斷檢驗。

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